מאָלעקולאַר דיאַגנאָסיס, קאַמאַנלי געניצט פּקר טעכנאָלאָגיע און פּרינציפּ

PCR, איז די פּאָלימעראַסע קייט רעאַקציע, וואָס רעפערס צו די אַדישאַן פון dNTP, Mg2+, ילאָנגגיישאַן סיבות און אַמפּלאַפאַקיישאַן ענכאַנסמאַנט סיבות צו די סיסטעם אונטער די קאַטאַליסיס פון דנאַ פּאָלימעראַסע, ניצן די פאָטער דנאַ ווי אַ מוסטער און ספּעציפיש אָנפאַנגער ווי די סטאַרטינג פונט פון פאַרלענגערונג, דורך די סטעפּס פון דענאַטוראַטיאָן, אַנילינג, פאַרלענגערונג, אאז"ו ו, דער פּראָצעס פון אין וויטראָ רעפּליקייטינג טאָכטער שנירל דנאַ קאַמפּלאַמענטשי צו די פאָטער שנירל מוסטער דנאַ קענען געשווינד און ספּאַסיפיקלי פאַרגרעסערן קיין ציל דנאַ אין וויטראָ.

1. הייס אָנהייב פּקר

דער אָנהייב צייט פון אַמפּלאַפאַקיישאַן אין קאַנווענשאַנאַל פּקר איז נישט צו שטעלן די פּקר מאַשין אין די פּקר מאַשין, און דער פּראָגראַם סטאַרץ צו פאַרגרעסערן.ווען די סיסטעם קאַנפיגיעריישאַן איז געענדיקט, די אַמפּלאַפאַקיישאַן הייבט, וואָס קען פאַרשאַפן ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן, און הייס-אָנהייב פּקר קענען סאָלווע דעם פּראָבלעם.

וואָס איז הייס אָנהייב פּקר?נאָך די אָפּרוף סיסטעם איז צוגעגרייט, די ענזיים מאָדיפיער איז באפרייט ביי הויך טעמפּעראַטור (יוזשאַוואַלי העכער ווי 90 ° C) בעשאַס די ערשט באַהיצונג בינע פון ​​דער אָפּרוף אָדער "הייס אָנהייב" בינע, אַזוי אַז די דנאַ פּאָלימעראַסע איז אַקטיווייטיד.די פּינטלעך אַקטאַוויישאַן צייט און טעמפּעראַטור אָפענגען אויף די נאַטור פון די דנאַ פּאָלימעראַסע און די הייס אָנהייב מאָדיפיער.דער אופֿן ניצט דער הויפּט מאָדיפיערס אַזאַ ווי אַנטיבאָדיעס, קירבות ליגאַנדז אָדער כעמיש מאָדיפיערס צו ינכיבאַט די טעטיקייט פון דנאַ פּאָלימעראַסע.זינט די טעטיקייט פון דנאַ פּאָלימעראַסע איז ינכיבאַטיד אין צימער טעמפּעראַטור, הייס אָנהייב טעכנאָלאָגיע גיט גרויס קאַנוויניאַנס פֿאַר פּריפּערינג קייפל פּקר אָפּרוף סיסטעמען אין צימער טעמפּעראַטור אָן סאַקראַפייסינג די ספּעציפֿישקייט פון פּקר ריאַקשאַנז.

2. רט-פּקר

RT-PCR (Reverse Transcription PCR) איז אַן יקספּערמענאַל טעכניק פֿאַר פאַרקערט טראַנסקריפּציע פון ​​מרנאַ אין cDNA און ניצן עס ווי אַ מוסטער פֿאַר אַמפּלאַפאַקיישאַן.די יקספּערמענאַל פּראָצעדור איז צו עקסטראַקט גאַנץ רנאַ אין געוועבן אָדער סעלז ערשטער, נוצן Oligo (dT) ווי אַ אָנפאַנגער, נוצן פאַרקערט טראַנסקריפּציע צו סינטאַסייז cDNA, און דערנאָך נוצן cDNA ווי אַ מוסטער פֿאַר פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן צו באַקומען די ציל דזשין אָדער דעטעקט דזשין אויסדרוק.

3. פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר

פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר (רעאַל-צייט קוואַנטיטאַטיווע פּקר,RT-qPCR) רעפערס צו דעם אופֿן פון אַדינג פלורעסאַנט גרופּעס צו די פּקר אָפּרוף סיסטעם, ניצן די אַקיומיאַליישאַן פון פלורעסאַנט סיגנאַלז צו מאָניטאָר די גאנצע פּקר פּראָצעס אין פאַקטיש צייט, און לעסאָף ניצן די נאָרמאַל ויסבייג צו קוואַנטיטאַטיוו אַנאַלייז די מוסטער.קאַמאַנלי געוויינט qPCR מעטהאָדס אַרייַננעמען SYBR Green I און TaqMan.

4. נעסטעד פּקר

נעסטעד פּקר רעפערס צו די נוצן פון צוויי שטעלט פון פּקר פּרימערז פֿאַר צוויי ראָונדס פון פּקר אַמפּלאַפאַקיישאַן, און די אַמפּלאַפאַקיישאַן פּראָדוקט פון די רגע קייַלעכיק איז די ציל דזשין פראַגמענט.

אויב אַ מיסמאַטש פון די ערשטער פּאָר פון אָנפאַנגער (ויסווייניקסט אָנפאַנגער) ז אַ ניט-ספּעציפיש פּראָדוקט צו זיין אַמפּלאַפייד, די מעגלעכקייט פון דער זעלביקער ניט-ספּעציפיש געגנט איז אנערקענט דורך די צווייטע פּאָר פון אָנפאַנגער און פאָרזעצן צו פאַרגרעסערן איז זייער קליין. אַמפּלאַפאַקיישאַן דורך די רגע פּאָר פון פּרימערז, די ספּעסיפיקייט פון פּקר איז ימפּרוווד.איין מייַלע פון ​​פּערפאָרמינג צוויי ראָונדס פון פּקר איז אַז עס העלפּס צו אַמפּלאַפיי גענוג פּראָדוקט פֿון לימיטעד סטאַרטינג דנאַ.

5. טאַטשדאַון פּקר

טאַטשדאַון פּקר איז אַ מעטאָד צו פֿאַרבעסערן די ספּעסיפיקייט פון פּקר אָפּרוף דורך אַדזשאַסטינג די פּקר ציקל פּאַראַמעטערס.

אין טאַטשדאַון פּקר, די אַנילינג טעמפּעראַטור פֿאַר די ערשטער ביסל סייקאַלז איז באַשטימט אַ ביסל דיגריז העכער די מאַקסימום אַנילינג טעמפּעראַטור (טם) פון די פּרימערז.העכער אַנילינג טעמפּעראַטור קענען יפעקטיוולי רעדוצירן ניט-ספּעציפיש אַמפּלאַפאַקיישאַן, אָבער אין דער זעלביקער צייט, העכער אַנילינג טעמפּעראַטור וועט פאַרשטאַרקן די צעשיידונג פון פּרימערז און ציל סיקוואַנסיז, ריזאַלטינג אין רידוסט פּקר טראָגן.דעריבער, אין דער ערשטער ביסל סייקאַלז, די אַנילינג טעמפּעראַטור איז יוזשאַוואַלי באַשטימט צו פאַרמינערן דורך 1 ° C פּער ציקל צו פאַרגרעסערן די אינהאַלט פון די ציל דזשין אין די סיסטעם.ווען די אַנילינג טעמפּעראַטור איז לאָוערד צו די אָפּטימום טעמפּעראַטור, די אַנילינג טעמפּעראַטור איז מיינטיינד פֿאַר די רוען סייקאַלז.

6. דירעקט פּקר

דירעקט פּקר רעפערס צו די אַמפּלאַפאַקיישאַן פון ציל דנאַ גלייַך פֿון דער מוסטער אָן די נויט פֿאַר ייסאַליישאַן און רייניקונג פון נוקלעיק זויער.

עס זענען צוויי טייפּס פון דירעקט פּקר:

דירעקט אופֿן: נעמען אַ קליין סומע פון ​​מוסטער און לייגן עס גלייך צו PCR Master Mix פֿאַר פּקר לעגיטימאַציע;

קראַקינג אופֿן: נאָך מוסטערונג די מוסטער, לייגן עס צו די ליסאַטע, ליס צו באַפרייַען די גענאָמע, נעמען אַ קליין סומע פון ​​​​ליסט סופּערנאַטאַנט און לייגן עס צו PCR Master Mix, דורכפירן פּקר לעגיטימאַציע.דער צוגאַנג סימפּלאַפייז די יקספּערמענאַל וואָרקפלאָוו, ראַדוסאַז האַנט-אויף צייט און אַוווידז דנאַ אָנווער בעשאַס רייניקונג סטעפּס.

7. סאָע פּקר

גענע סלייסינג דורך אָוווערלאַפּ פאַרלענגערונג PCR (SOE PCR) ניצט אָנפאַנגער מיט קאַמפּלאַמענטשי ענדס צו מאַכן PCR פּראָדוקטן פאָרעם אָוווערלאַפּינג קייטן, אַזוי אַז אין די סאַבסאַקוואַנט אַמפּלאַפאַקיישאַן אָפּרוף, דורך די פאַרלענגערונג פון די אָוווערלאַפּינג קייטן, פאַרשידענע קוואלן פון א טעכניק אין וואָס אַמפּלאַפייד פראַגמאַנץ זענען אָוווערלאַפּט. און צוזאַמען צוזאַמען.די טעכנאָלאָגיע דערווייַל האט צוויי הויפּט אַפּלאַקיישאַן אינסטרוקציעס: קאַנסטראַקשאַן פון פוסיאָן גענעס;גענע פּלאַץ-דירעקטעד מיוטיישאַן.

8. יפּקר

פאַרקערט פּקר (IPCR) ניצט פאַרקערט קאַמפּלאַמענטשי אָנפאַנגער צו פאַרשטאַרקן דנאַ פראַגמאַנץ אנדערע ווי די צוויי אָנפאַנגערס, און אַמפּלאַפייז אומבאַקאַנט סיקוואַנסיז אויף ביידע זייטן פון אַ באַוווסט דנאַ פראַגמענט.

IPCR איז ערידזשנאַלי דיזיינד צו באַשטימען די סיקוואַנס פון שכייניש אומבאַקאַנט מקומות, און איז מערסטנס געניצט צו לערנען דזשין פּראָמאָטער סיקוואַנסיז;אָנקאָגעניק כראָמאָסאָמאַל ריעריינדזשמאַנץ, אַזאַ ווי דזשין פוסיאָן, טראַנסלאָקאַטיאָן און טראַנספּאָסיטיאָן;און וויראַל דזשין ינאַגריישאַן, זענען אויך קאַמאַנלי געניצט איצט.

9. דפּקר

דיגיטאַל פּקר (דפּקר) איז אַ טעכניק פֿאַר די אַבסאָלוט קוואַנטאַפאַקיישאַן פון נוקלעיק זויער מאַלאַקיולז.

עס זענען דערווייַל דריי מעטהאָדס פֿאַר די קוואַנטאַפאַקיישאַן פון נוקלעיק זויער מאַלאַקיולז.פאָטאָמעטרי איז באזירט אויף די אַבזאָרבאַנס פון נוקלעיק זויער מאַלאַקיולז;פאַקטיש-צייט פלורעסאַנט קוואַנטיטאַטיווע פּקר (רעאַל צייט פּקר) איז באזירט אויף די Ct ווערט, און די Ct ווערט רעפערס צו די ציקל נומער קאָראַספּאַנדינג צו די פלורעסאַנס ווערט וואָס קענען זיין דיטעקטאַד;דיגיטאַל פּקר איז די לעצטע קוואַנטיטאַטיווע טעכנאָלאָגיע באזירט אויף איין מאַלאַקיול פּקר אופֿן פֿאַר קאַונטינג נוקלעיק זויער קוואַנטיפיקאַטיאָן איז אַן אַבסאָלוט קוואַנטיטאַטיווע אופֿן.